Sekrecja IL-6 została potwierdzona przez ELISA w panelu zawierającym kilka dodatkowych świeżo wyizolowanych nowotworów płuc BALB / c TKO i nie stwierdzono go na wysokich poziomach w innych zbadanych liniach komórek nowotworu myszy, w tym LL (Figura 4A i dane nie przedstawione). Co więcej, sekrecja IL-6 nie była zależna od makrofagów związanych z nowotworem, ponieważ IL-6 była łatwo wykrywalna w hodowlach nowotworów, w których niewielka populacja komórek CD11b + została usunięta (dane nie pokazane). Reasumując, odkrycia te sugerują model, w którym dysregulacja immunologiczna u młodych zwierząt, prawdopodobnie wynikająca z niedostatków wychwytu apoptotycznego za pośrednictwem MFG-E8, wywołuje zapalne mikrośrodowisko płucne bogate w IL-6 (23). W miarę rozwoju nowotworów selektywny nacisk sprzyja powstawaniu nowotworów o zdolności do autokrynnej produkcji IL-6; dowody wskazujące na silne selektywne ciśnienie do wytwarzania IL-6 przez komórki nowotworowe przedstawiono poniżej (Figura 5). Figura 4 Przeszczepione linie komórek nowotworowych BALB / c TKO wywołują silną odpowiedź gospodarza. (A) Analiza wydzielania cytokin przez linie komórek nowotworowych płuc BALB / c TKO (MDAC1, MDAC8) przy użyciu fluorescencyjnych kulek anty-cytokinowych. * P <0,05, MDAC8 w porównaniu z torbielą LL (B) związaną z przeszczepionym guzem płuc BALB / c TKO. (C) Analiza zawartości torbieli za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu wskazanych przeciwciał; Liczby są średnią z 2 torbieli związanych z nowotworem zebranych z oddzielnych zwierząt. (D) Kwantyfikacja ekspansji komórek immunologicznych w śledzionach myszy z przeszczepionymi nowotworami BALB / c TKO. Typy komórek identyfikowano za pomocą cytometrii przepływowej. Wyniki są łączone z 3 niezależnych eksperymentów z 2. 3 zwierzętami na grupę. Paski błędów przedstawiają SEM. * P <0,05, ** P <0,005, wstrzyknięte MDAC8 w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi (a). Figura 5 Przekroczenie IL-6 zmniejsza proliferację linii komórkowej nowotworu płuc BALB / c TKO. (A) x 104 komórek MDAC8 zainfekowanych lentiwirusami kodującymi shrna (scr) nie kierowania lub shRNA przeciwko IL-6 (KD-1 i KD-2) hodowano przez 3 dni w RPMI; supernatanty zebrano i całkowitą IL-6 zmierzono za pomocą testu ELISA. (B) Western blot do cytoplazmatycznego pERK (górne panele) lub jądrowego (nuc) STAT3 (dolne panele) z zastosowaniem lizatów z komórek MDAC8 z IL-6. Knockdown lub kontrolnych (scr). (C i D) Wzrost komórek MDAC8 in vitro (C) i in vivo (D) wyrażających shRNA IL-6 w porównaniu z komórkami wyrażającymi kontrole nie kierowania. (C) x 104 komórek hodowano w RPMI. Wzrost mierzono za pomocą CellTiter-Glo (CTG, Promega). (D) Lewy panel: 4 x 104 komórki wstrzyknięto podskórnie myszom BALB / c TKO, z 8 zwierzętami na grupę. Prawy panel: Przetrwanie myszy niosących nowotwory. (E) Porównanie wytwarzania IL-6 z hodowanych ex vivo IL-6 KD-2 lub kontrolnych linii komórkowych MDAC8 po wzroście u gospodarza wtórnego (ex vivo) lub po hodowli in vitro (linia podstawowa). Stosowano trzy do czterech nowotworów na grupę. (AEE) Wyniki są reprezentatywne dla co najmniej 2 niezależnych eksperymentów, z 6. 8 powtórzeń na doświadczenie. Paski błędów przedstawiają SEM dla pokazanego eksperymentu. Większość nowotworów płuc BALB / c TKO3 nie mogła być utrzymana w hodowli tkankowej, ale byliśmy w stanie ustalić kilka linii komórkowych, które propagują jako podskórne lub dopłucne masy u wtórnych gospodarzy, potwierdzając złośliwość pierwotnych guzów. Po transplantacji do wtórnych gospodarzy guzy BALB / c TKO wywołały nieoczekiwanie silną reakcję zapalną, charakteryzującą się tworzeniem dużych struktur torbielowatych i znacznym napływem makrofagów i neutrofili, a także komórek T i komórek B (Figura 4, B i C ). Te reakcje zapalne obserwowano zarówno u gospodarzy WT, jak i TKO, a niektóre linie komórkowe stanowiły większość masy guza [patrz też: kardiowersja elektryczna, kora debu, kalarepa kalorie ]