Schemat ideowy elastycznej przyspieszonej Neo-STOP kasety indukowalnej tetracykliną (FAST) ilustrujący generowanie globalnych nokautowych myszy NaV1.9 (czerwona ramka) i ekspresji znakowanej samouczkiem myszy NaV1.9 znakowanej SFGF (zielona ramka) ). (C) Sekcja DRG z myszy NaV1.9 (na górze) z tagiem sfGFP i myszy WT (na dole) pokazujące nakładanie się między endogennym sygnałem fluorescencyjnym (zielonym) i autofluorescencją, a następnie barwienie przeciwciałem przeciwko GFP (czerwone). (D) Western blot tkanki DRG z WT, sfGFP-NaV1.9 i NaV1.9. /. mysz barwiona na GFP. Przeciwciało HSP90 zastosowano jako kontrolę obciążenia. (E) Western blot tkanek pobranych od myszy sfGFP-NaV1.9 i zabarwionych na GFP, odpędzono i powtórzono w przypadku NaV1.9, stosując komercyjne przeciwciało. Przeciwciało HSP90 zastosowano jako kontrolę obciążenia. TG, zwoje trójdzielne. (F i G) Reprezentatywne ślady prądu z linii komórkowych ND7 / 23 wyrażających kanały WT (czarne) lub sfGFP-NaV1,9 (zielone). (H. J) Napięcie prądu (IV) (H) i wyprowadzone napięcie przewodnictwa (GV) (I) i zależności inaktywacji w stan ustalony (SSI) (J) WT (czarny) i sfGFP-NaV1.9 (zielony ). (GV: WT-NaV1, 9 V1 / 2 = A 25,5 . 0,5 mV, n = 16, GFP-NaV1, 9 V1 / 2 = <24,0> 0,2 mV, n = 11, P = 0,52; SSI: WT-NaV1 .9 Vl / 2 => 29,3> 3,5 mV, n = 7; GFP-NaV1, 9 Vl / 2 = <26,6 <1,7 mV, n = 7, P = 0,49). Dane są reprezentowane jako średnie. SEM. Pasek skali: 50 .m. Generowanie i charakteryzowanie linii myszy NaV1 oznaczonej sfGFP. Aby określić wzór ekspresji NaV1.9, zastosowaliśmy linię myszy, w której kanał został połączony z fluorescencyjnym reporterem. Aby ograniczyć wpływ na funkcję i ekspresję NaV1.9, używaliśmy (a) superfolderu zielonego białka fluorescencyjnego (sfGFP), generacji GFP o wzmocnionej kinetyki fałdowania (34); (b) ukierunkowane na N-koniec kanału dla fuzji sfGFP (17, 35); i (c) zoptymalizowany pod względem kodonów (36) sfGFP. Korzystając z elastycznej przyspieszonej techniki indukowalnej tetracykliną (FAST) Neo-STOP (37), wstawiliśmy sfGFP natychmiast po endogennym kodonie start (rysunek 1B). Oryginalna kaseta domina zawierała konstrukt (loxP-FRT-Neo-STOP-FRT-tetO-loxP), który doprowadził do globalnego fenotypu nokautu NaV1.9 (myszy NaV1, 9 (3 / / FAST). Ten szczep miał dodatkową zaletę, że był zdolny do (a) kontrolowanej tetracykliną kontrolowanej przez transaktywator (zależnej od tTA) i (b) kontrolowanego tetracykliną pośredniego tłumienia warunkowego transkrypcji z udziałem tTS (za pośrednictwem tTS) (Figura 1B). Przez skrzyżowanie myszy SFGFP-NaV1.9 FAST (C57BL / 6J) z globalną myszą Cre (B6.C-Tg (CMV-cre) 1Cgn; The Jackson Laboratory), uzyskano linię, w której endogenny NaV1.9 był N- ostatecznie połączony z SFGFP. Jak widać na Figurze 1C, podzbiór zdysocjowanych DRG wykazywał silny sygnał fluorescencji, który pokrywał się z przeciwciałem GFP, podczas gdy tkanka WT wykazywała słabą fluorescencję tła. Analiza biochemiczna DRG wykazała obecność prążka GFP + w odpowiedniej wielkości dla znaczonego sfGFP NaV1.9, którego nie obserwowano w mysich DRG zawierających kasetę WT lub FAST (Figura 1D). Odpowiednio, ilościowa PCR z odwrotną transkryptazą (RT-qPCR) nie wykryła RNA NaV1.9 w DRG myszy FAST. Blotting dla GFP, a następnie odpędzanie i ponowne badanie Western blot przy użyciu przeciwciała NaV1.9 (38) ujawniło dodatni prążek zarówno w DRG, jak i zwojach nerwu trójdzielnego. Oprócz tych tkanek ekspresja NaV1.9 nie była obserwowana w mózgu ani innych głównych narządach (Figura 1E). Po potwierdzeniu ekspresji fluorescencji, próbowaliśmy następnie ustalić, czy właściwości bramkujące sfGFP znakowanego NaV1.9 zostały zmienione w porównaniu z nieonagodzonym NaV1.9. Nagrania patch-clamp z fluorescencyjnych neuronów czuciowych w obecności tetrodotoksyny (TTX) i CsF w pipecie z łatką ujawniły funkcjonalny kanał sfGFP-NaV1.9 z zachowaniem bramkowania WT i kinetyką, jak opisano w literaturze (ref. [więcej w: kozieradka zastosowanie, olx myślenice, uxtorpeda allegro ]