proktolog w poznaniu

W celu dalszej walidacji prawidłowej funkcji kanału, skonstruowaliśmy mysie linie komórkowe ND7 / 23 oparte na DRG NaV1.9 i sfGFP-NaV1.9 stabilne DRG pochodzące od DRG, łącząc system Flp-In oparty na rekombinacji Flp (oparty na FRT) (Thermo Fisher) Naukowe) z intronowym wzmocnieniem ekspresji genów, techniką, która prowadzi do zwiększonej akumulacji mRNA i białka w stosunku do niezmienionego cDNA (44). Dodatkową korzyścią tego podejścia było zmniejszenie niepożądanych zdarzeń przegrupowania podczas propagacji cDNA kanału NaV w bakteriach. Mysi gen SCN11a jest kodowany przez 24 eksony o znanych granicach egzon / intron (45). Chociaż nie uzyskano wystarczającej ekspresji przy użyciu mysiego cDNA pozbawionego endogennego intronu lub z dodatkiem C-końcowego GFP (46), konsekwentnie widzieliśmy prąd NaV1.9 z cDNA zawierającym intron 2, który zwiększał się po różnicowaniu komórek ND7 / 23 w pożywka zawierająca NGF (100 ng / ml) i 1% FBS (Figura 1, F i G). RT-PCR i sekwencjonowanie potwierdziły prawidłowe wycięcie intronu 2 w celu utworzenia dojrzałych kanałów (45). Nagrania patch-clamp z tych komórek wykazały prądy kanału sfGFP-NaV11,9 i WT z praktycznie identycznymi właściwościami bramkowania i kinetyką (Figura 1, H. J). NaV1.9 jest głównie eksprymowany w niemielinizowanych DRG o małej średnicy. Wykorzystaliśmy znacznik sfGFP do określenia ekspresji NaV1.9 w mysich podtypach DRG. Używając IHC z przeciwciałem GFP, stwierdziliśmy, że wszystkie komórki sfGFP + nakładają się na pery- perynę, marker peryferyjnych neuronów czuciowych (Figura 2A). Zaobserwowaliśmy także silne nakładanie się sfGFP i IB4 (Figura 2B, 86%) i c-Ret (Figura 2C, 89%), 2 markery dla nie-mielinowanych niepeptydowych włókien o małej średnicy. Wykryliśmy niewielką część komórek sfGFP +, które pokrywają się z peptydem pokrewnym genem kalcytoniny (CGRP), co wskazuje na subpopulację neuronów NaV1.9 +, które są peptydergiczne (Figura 2D; 12%). Rzadko zauważaliśmy powszechność NaV1.9 za pomocą NF200, markera dla neuronów o dużej średnicy (ryc. 2E, 1,5%). NaV1.9 jest związany z przeczulicą termiczną w warunkach zapalnych (23, 25, 47), a my rzeczywiście stwierdziliśmy znaczące zachodzenie na siebie z TRPV1 (Figura 2F, 35%), markerem dla podgrup czułych na nocyceptor (48). Jednak te komórki TRPV1 + miały niską ekspresję NaV1.9 (Figura 2F, groty strzałek). Znacząco, DRG SFGFP + wykazywały niewielkie lub żadne nakładanie się z TRPV2 (Figura 2G, 5%). Na koniec nie zaobserwowaliśmy NaV1.9 w komórkach wyrażających hydroksylazę tyrozynową (49), które były zaangażowane w allodynię (50) (Figura 2H, 0,7%). Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, wykryliśmy NaV1.9 w małych i średnich neuronach, które stanowią większość nocyceptorów i pruriceptorów (ryc. 2, I i J). Ponadto skrzyżowaliśmy nasze homozygotyczne myszy sfGFP-NaV1.9 myszami NaV1.8-Cre-tdTomato, które eksprymują rekombinazę Cre pod kontrolą promotora NaV1.8 w celu indukcji białka fluorescencyjnego tdTomato w neuronach wyrażających NaV1.8 (51) . W rezultacie odkryliśmy rozległe nakładanie się ekspresji NaV1.8 i NaV1.9 (dodatkowa Figura 2A). Badaliśmy również ekspresję NaV1.9 w zwojach nerwu błędnego odpowiedzialnych za przekazywanie bodźców z narządów takich jak serce, krtań, płuca i przewód pokarmowy do ośrodkowego układu nerwowego (1). Tutaj stwierdziliśmy, że wszystkie neurony NaV1.9 + eksprymowały marker pan-neuronowy PGP9.5 (dodatkowa Figura 2B) i wykryli rozległą ekspresję NaV1.9 w zwojach szyjnych (Suplemental Fig. 2C); jednak nie znaleźliśmy komórek o wysokim poziomie ekspresji NaV1.9 w zwojach guzkowych (Supplemental Figure 2D). Na koniec określiliśmy ekspresję NaV1.9 na centralnych i obwodowych końcach DRG. Sygnał fluorescencyjny pokrywa się w znacznym stopniu z IB4 w wewnętrznej części warstwy II rogu grzbietowego, gdzie łączenie interneuronów może być zaangażowane w oddziaływanie na obwody świądowe (52, 53) (rysunek 2K)
[hasła pokrewne: klasterowe bóle głowy, kalafior wartości odżywcze, kora debu ]