mcz lubin dermatolog

Samce i samice myszy (8-12 tygodni, 20-30 g każda) użyto do eksperymentów. Wszystkie zachłyśnięcia zachodziły między godziną 8 a 12 wieczorem. W dniu poprzedzającym eksperyment zwierzęta umieszczono w komorze testowej na 30 minut przed poddaniem serii 3-krotnych iniekcji z 5-minutowymi przerwami pomiędzy nimi. W dniu eksperymentu zwierzętom pozwolono na aklimatyzację do komory testowej przez 10 minut przed wstrzyknięciem. Związki świądowe wstrzykiwano sc do karku, a zachowanie drapania obserwowano przez 30 minut. Atak drapania został zdefiniowany jako ciągłe drapanie, a nie wycieranie, ruch przez tylną łapę skierowaną w obszar miejsca wstrzyknięcia. Zarysowanie drapania oceniano ilościowo przez zliczenie liczby drapańców w ciągu 30-minutowego okresu obserwacji. Stężenia stosowane dla wszystkich związków wynosiły mM rozpuszczony w soli fizjologicznej. Hodowle zdysocjowanych neuronów DRG. Dorosłe myszy (8-12 tygodni) znieczulono CO2, a następnie kręgosłupa szyjnego. Kręgosłup został usunięty i usunięty z nadmiaru mięśni. Następnie kręgosłup został podzielony na pół, a jedna strona została umieszczona na szalce Petriego z zimnym DMEM bez wodorowęglanów (bfDMEM, Thermo Fisher Scientific), podczas gdy DRG zebrano z drugiej strony. Na oddzielnej płytce Petriego DRG zebrano do zimnego bfDMEM. Po zebraniu wszystkich zwojów zastosowano kleszcze i cienkie nożyczki do przycięcia nadmiaru nerwów z zwojów. Przycięte zwoje umieszczono w 15 ml probówce Falcon z 4 ml mieszaniny enzymów przez 30 minut w 37 ° C. Mieszanka enzymów składała się z 0,78 mg / ml proteazy (Worthington) i 1,25 mg / ml kolagenazy I (Worthington) w 4 ml bfDMEM. Po inkubacji zwoje odwirowano przy 50 obrotach na minutę przez 5 minut. Roztwór enzymu usunięto, a zwoje płukano kompletnym DMEM (10% FBS, x penicylina / streptomycyna), a następnie odwirowywano przy 600 obrotach na minutę. Po etapie odwirowania zwoje zostały roztarte z 1-ml pipetkami 20-30 razy lub dopóki nie pozostały duże kawałki tkanki. Zdysocjowane komórki przeniesiono przez filtr o średnicy 100 .m (Thermo Fisher Scientific). Następnie komórki odwirowano przez 5 minut przy 600 obrotach na minutę. Po tym etapie usuwający roztwór usunięto i zastąpiono 200-400 ul lub objętością pożywki do hodowli komórkowej (kompletna DMEM, 10% FBS, x penicylina / streptomycyna) niezbędną do obniżenia pożądanej gęstości komórek na poli-d. -lipsydiowaty szkiełko nakrywkowe w 24-studzienkowych płytkach (Thermo Fisher Scientific). Około 60 80 80 ll roztworu komórek naniesiono na środek szkiełka nakrywkowego. Komórki pozostawiono do osadzenia na 30 minut, a następnie studzienkę zalano 500 .l dodatkowej pożywki do hodowli komórkowej. Immunofluorescencja. Dorosłe myszy (w wieku 8-12 tygodni) znieczulono CO2 i perfundowano 15 ml 0,1 M PBS (pH 7,4, 4 ° C), a następnie 25 ml utrwalacza (4% paraformaldehydu [obj./obj.] I 14% nasyconego kwasu pikrynowego [vol / vol] w PBS, 4 ° C). Rdzeń kręgowy i DRG zostały wycięte z perfundowanych myszy. DRG utrwalano w utrwalaczu w 4 ° C przez 30 minut, a rdzeń kręgowy ustalano na 2 godziny. Skórę wycięto z nieperfumowanych myszy i utrwalono w 2% paraformaldehydzie (obj./obj.) Przez 2. 4 godziny w 4 ° C. Po utrwaleniu tkanki płukano 0,1 M PBS 3 razy przez 5 minut każdy. Wszystkie tkanki były krioprotektowane w 20% roztworze sacharozy (wt / vol) przez ponad 24 godziny i były cięte za pomocą kriostatu w odległości 20 .m dla DRG i nerwów i 30 .m dla rdzenia kręgowego i skóry. DRG i sekcje nerwowe suszono w 37 ° C przez 30 minut. Etap pobierania antygenu prowadzono również z cytrynianem sodu (10 mM, pH 6 i 0,05% Tween-20) przez 10 minut w 85 ° C, a następnie 3 razy po 5 minut z 0,1 M PBS. Tkankę wstępnie inkubowano z roztworem blokującym (10% FBS [obj./obj.], 0,1% Triton X-100 [obj./obj.] W PBS, pH 7,4) przez 1-2 godzin, a następnie inkubowano przez noc w 4 ° C z pierwszorzędowymi przeciwciałami.
[przypisy: kolano budowa, olx sulechów, mcz lubin ]