ginekologia piaseczno

Wtórną inkubację przeciwciał przeprowadzono przez 2 godziny w roztworze blokującym w 22 ° C . 23 ° C. Trzy przemycia PBS (0,1% Triton X-100) przez 5 minut każdy przeprowadzono pomiędzy inkubacjami. W przypadku rdzenia kręgowego i skóry, skrawki kriostatu pocięto na 30 urn i umieszczono w 0,1 M buforze fosforanowym do immunobarwienia na całym wierzchu. Skrawki następnie inkubowano w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie skrawki inkubowano w pierwszorzędowym przeciwciarzu przez noc w 4 ° C z łagodnym wytrząsaniem przez co najmniej 24 godziny. Po podstawowej inkubacji 3 razy płukano przez 5 minut, a następnie inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Na koniec, sekcje przemyto jeszcze 3 razy przez 5 minut każdy, a następnie dwukrotnie przemyto H2O i umieszczono na szkiełku nakrywkowym. Zastosowano następujące pierwszorzędowe przeciwciała: kurczę przeciw GFP (1: 2000, GFP-1020, Aves Labs), królicze anty-sfGFP (1: 2000, dar od Ramanujana Hegde, University of Cambridge, Cambridge, Wielka Brytania); królik przeciw GFP (1: 2000, ab290, Abcam); królik anty-NF200 (1: 500; AB1989, Millipore); królicze przeciwciało P (1: 1000, AB1566, Millipore); królicza hydroksylaza antytyrozynowa (1: 500; P40101-150, Pel-Freeze); koza anty-c-Ret (1: 500; AF482, Novusbio); królik przeciw PGP9.5 (1: 500, PA5-29012, Thermo Fisher Scientific); królicze anty-CGRP (1: 500; T-4239, Peninsula Laboratories); i anty-peryferynę (1: 200, ab4666, Abcam). Aby wykryć wiązanie IB4, skrawki inkubowano z biotynylowaną Griffonia simplicifolia isolectin GS-IB4 (1: 500, B-1205, Vector Laboratories). W przypadku przeciwciał drugorzędowych stosowaliśmy osioł anty-królika (A31572, Alexa Fluor 555 sprzężony), kozie anty-kurczę (A21103, Alexa Fluor 488 skoniugowane) i króliczą anty-kozę (A214310, Alexa Fluor 555 sprzężone) (wszystkie z Thermo Fisher Naukowe), a dla biotynylowanego IB4, użyliśmy streptawidyny (DyLight 549, SA-5549, Vector Laboratories). Wszystkie drugorzędowe przeciwciała rozcieńczono 1: 500 w roztworze blokującym. Western blot. Dorosłe myszy (8-12 tygodni) znieczulono CO2, a następnie kręgosłupa szyjnego. DRG i zwoje nerwu trójdzielnego wypreparowano i umieszczono w 300 ul buforze do lizy (w mM: 320 sacharozy, 10 HEPES, 2 EDTA, pH 8,0, 1,25% Triton X-100, 50 U / ml benzonaza, Roche Protease Inhibitor Mini Tablet) . Tkankę homogenizowano w ml homogenizatora Dounce przez 5-10 minut na lodzie. Próbki następnie obracano w 4 ° C przez godzinę. Po tym etapie roztwór tkanki odwirowano przy 15000 rpm przez 20 minut w 4 ° C. Supernatant z białkiem usunięto i umieszczono w nowej probówce i przechowywano w temperaturze. 20 ° C aż do dalszego użycia. Wszystkie pozostałe tkanki umieszczono w perełkach do lizy (Matrix D, MP Biomedicals) w probówkach o pojemności 2 ml i trzymano na lodzie. Następnie probówki umieszczono w homogenizatorze stacjonarnym (homogenizator FastPrep-24 Classic Instrument, MP Biomedicals) i homogenizowano stosując program na zamówienie (prędkość 4 m / s przez 20 sekund). Ten etap powtórzono, jeśli tkanka nie była całkowicie homogenizowana. Próbki następnie odwirowano przy 15000 rpm przez 20 minut. Supernatant z białkiem usunięto i umieszczono w nowej probówce i przechowywano w temperaturze. 20 ° C aż do dalszego użycia. Stężenie białka określono przy użyciu testu BCA (Pierce). Wszystkie próbki białka zostały odpowiednio rozcieńczone w × LDS (Thermo Fisher Scientific) plus środek redukujący (Thermo Fisher Scientific). Dziesięć mikrogramów białka przepuszczono przez 3% 8% żele octanu tris (Thermo Fisher Scientific) z buforem Tris-octan i analizowano za pomocą analizy Western. Błony nitrocelulozowe inkubowano w buforze blokującym (5% BSA, 0,1% Tween-20, w x TBS), a następnie sondowano przez noc w 4 ° C z odpowiednimi pierwszorzędowymi przeciwciałami i 2 godziny w temperaturze pokojowej z 1: 10 000 kozim anty-mysim HRP sprzężone przeciwciało jako przeciwciało drugorzędowe (Thermo Fisher Scientific) Membrany inkubowano przez 5 minut ze wzmocnionym substratem chemiluminescencyjnym przed obrazowaniem (Thermo Fisher Scientific). Użyte pierwotne przeciwciała to królicze anty-sfGFP (1: 2000, dar od Ramanujana Hegde), królicze anty-NaV1.9 (1: 5000, ASC-0
[podobne: bogowie cda, kolano budowa, kozieradka zastosowanie ]