Chociaż czasami widzieliśmy większe gęstości prądu NaV1.9, nie stwierdziliśmy znaczącego wzmocnienia NaV1.9 lub NaV1,8. Jednakże zastosowanie histaminy spowodowało hiperpolaryzowane przesunięcie napięcia aktywacyjnego o 6,5 mV w prądzie TTX-R (Figura 6, M. R). Obserwację, że nie wszystkie komórki wykazywały ten efekt w odpowiedzi na histaminę można wyjaśnić przez populację neuronów reagujących na histaminę tylko częściowo zachodzących na komórki reagujące na CQ i BAM8-22. Dlatego możliwe jest, że komórkom, które nie reagują, brakowało odpowiednich receptorów dla histaminy. Aby dodatkowo ocenić, czy CQ lub BAM8-22 wpłynęły na prądy NaV1.8, przejściowo transfekowaliśmy mysie NaV1.8 razem z MrgprA3 lub MrgprC11 w komórkach ND7 / 23. W komórkach zawierających NaV1.8 i MrgprA3, nie widzieliśmy zmienionej kinetyki aktywacji kanału po zastosowaniu CQ; jednakże zaobserwowaliśmy podobne zmniejszenie gęstości prądu w zakresie napięć (dodatkowa ilustracja 4, A i C). W komórkach transfekowanych NaV1.8 i MrgprC11, zanotowaliśmy porównywalne gęstości prądu i właściwości aktywacji kanału przed i po zastosowaniu BAM8-22 (Suplementowa Figura 4, B i D). Mutacja NaV1.9L799P / WT prowadzi do zwiększenia świądu u myszy. Następnie zastosowaliśmy strategię CRISPR / Cas9, aby wprowadzić ortologiczną mutację wzmocnienia funkcji p.L811P (c.2432T> C) do mysiego NaV1.9 (L799P / WT; c.2396T> C) w stosunku do naszego tła kasetowego tetO ( mysie i ludzkie białka NaV1.9 są w 73% identyczne). Po 5 krzyżowaniach wstecznych (najpierw z B6.C-Tg (CMV. Cre) 1Cgn globalna mysz Cre z The Jackson Laboratory), wykonaliśmy testy swędzenia na linii myszy L799P / WT i porównaliśmy dane z tymi otrzymanymi za pomocą WT NaV1.9. myszy (Figura 7A). Podobnie jak w przypadku pacjentów z ludzkim p.L811P + / WT, myszy L799P / WT wykazywały silne spontaniczne drapanie w porównaniu z kontrolnymi z miotu WT (Figura 7B). Wirtualna zgoda z poprzednimi obserwacjami (22), analiza RT-qPCR DRG z myszy sfGFP-NaV1.9L799P / WT ujawniła 68% redukcję ogólnych poziomów RNA SCNlla w porównaniu z poziomami w kontrolach WT (dodatkowa Figura 5). Figury Myszy 7sfGFP-NaV1.9L799P / WT wykazują wyższe bazowe zarysowania i więcej neuronów reagujących na CQ. (A) Schemat ideowy pokazujący wstawioną kasetę początkową do generowania myszy sfGFP-NaV1.9L799P / WT i następnej hodowli w celu wytworzenia myszy do eksperymentów. (B) Myszy sfGFP-NaV1.9L799P / WT wykazywały wyższy poziom zarysowania w porównaniu z ich kontrolkami z miotu (WT n = 8, sfGFP-NaV 1,9L799P / + n = 9, P = 0,043). (C = H) Ratiometryczne badania obrazowania Ca2 + Fura-2 przeprowadzono na myszach sfGFP-NaV1.9L799P / + i kontrolach z miotu. Po podaniu histaminy nie zaobserwowano żadnych różnic w całkowitym odsetku neuronów odpowiadających na leczenie (C, WT i sfGFP-NaV 1,9L799P / WT n. 700 komórek, P = 0,15) ani na podstawie wielkości odpowiedzi (D, WT i NaV1.9 p / yl <700 komórek, P = 0,36). W przypadku BAM8-22 nie zaobserwowano żadnych różnic ani w przypadku odsetka komórek reagujących (E, WT i sfGFP-NaVl, 19L799P / WT nf 700 komórek, P = 0,19) ani wielkości odpowiedzi (F; WT i sfGFP- Komórki NaV1,9 779P / WT n = 700, P = 0,83). W przypadku CQ odsetek komórek reagujących był znacząco wyższy (G, WT i sfGFP-NaVl, 9L799P / WT n. 700 komórek, n = 0,042), ale nie zaobserwowano żadnej różnicy w wielkości odpowiedzi (H; WT i sfGFP). -NaV1, 9L799P / WT n = 700 komórek, P = 0,59). (I) RMP w MrgprA3 + DRG z WT (<40,0. 1,3 mV, n = 13) i myszy NaV1,9L799P / WT (. 23,9. 1,8 mV, n = 21) różnią się znacznie (P = 0,0007). (J. L) WT MrgprA3 + neurony wymagają. 50 pA prądu do wstrzykiwań w impuls (J), podczas gdy MrgprA3 +; NaV1.9L799P / WT DRG składają się z podzestawu (17/21), który nie strzela z AP przy dużych zastrzykach prądu (. 500 pA; RMP => 42 mV) i mniejszej grupy (4/21), które wystrzeliwują w odpowiedzi na obecne wstrzyknięcia tak niskie, jak 10 pA i powtarzające się punkty AP w 50 pA (RMP = <26 mV) (K i L) [podobne: klasyfikacja icd 10, olx sulechów, klasterowe bóle głowy ]