Funkcjonalny element odpowiedzi cyklicznego AMP odgrywa kluczową rolę w ekspresji specyficznej dla typu neuroendokrynnego komórki wydzielniczej chromograniny A.

Chromogranina A, rozpuszczalne kwaśne białko, jest wszechobecnym składnikiem pęcherzyków wydzielniczych w układzie neuroendokrynnym. Wcześniej opisywaliśmy klonowanie i wstępną charakterystykę mysiego promotora genu chromograniny A, który wykazał, że promotor zawiera zarówno domeny dodatnie, jak i ujemne, oraz że proksymalny promotor obejmujący nukleotydy od -147 do +42 bp w stosunku do miejsca startu transkrypcji jest wystarczający dla neuroendokrynny. ekspresja specyficzna dla typu komórki. Obecne badania zostały podjęte w celu zidentyfikowania poszczególnych elementów w obrębie tego proksymalnego promotora, które kontrolują ekspresję tkankową. Stwierdziliśmy, że mutacje delecyjne lub punktowe w potencjalnym miejscu elementu odpowiedzi cAMP (CRE) przy -68 bp praktycznie zniosły aktywność promotora specyficznie w komórkach neuroendokrynnych (chromatyna PC12 lub kortykotrop AtT20), z niewielkim wpływem na aktywność komórek kontrolnych (NIH3T3 fibroblast); w ten sposób pole CRE jest niezbędne dla specyficznej dla typu neuroendokrynnego aktywności promotora chromograniny A. Ponadto, efekt miejsca CRE wzrasta w kontekście nienaruszonych sekwencji (promotor typu dzikiego) pomiędzy -147 i -100 pz. Analiza footprintu DNase I wykazała, że te regiony (w tym pole CRE) wiążą białka jądrowe obecne zarówno w komórkach neuroendokrynnych (AtT20), jak i kontrolnych (NIH3T3). W komórkach AtT20 testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej i supersvift przeciwciał swoistych dla czynnika pokazały, że oligonukleotyd zawierający miejsce chromograniny A CRE tworzy pojedynczy, homogenny kompleks białko-DNA zawierający białko CREB wiążące CRE. Jednak w kontrolnych komórkach NIH3T3 znaleźliśmy dowody na dodatkowe immunologicznie niespokrewnione białko w tym kompleksie. Pojedyncza kopia tego oligonukleotydu była zdolna do nadawania specyficznej dla neuroendokrynnej ekspresji heterologicznemu promotorowi kinazy tymidynowej, chociaż z mniejszą selektywnością niż pełny proksymalny promotor chromograniny A. W związku z tym miejsce CRE było częściowo wystarczające do wyjaśnienia specyficzności typu promotora w komórkach neuroendokrynnych. Aktywność funkcjonalną miejsca CRE potwierdzono w badaniach endogennego genu chromograniny A. Analiza Northern mRNA wykazała, że ekspresja endogennego genu chromograniny A była stymulowana siedmiokrotnie do ośmiokrotnie przez cAMP w komórkach PC12, podczas gdy w komórkach NIH3T3 nie nastąpiła indukcja. Podobne indukowanie cAMP uzyskano z transfekowanym promotorem chromograniny A w komórkach PC12, a zniesienie miejsca CRE (przez delecję lub mutację punktową) wyeliminowało indukcję. Zatem miejsce CRE w proksymalnym promotorze chromograniny A jest funkcjonalne i odgrywa kluczową, rzeczywiście niezbędną rolę w ekspresji genu specyficznej dla neuroendokrynny. Wyniki te zapewniają również wgląd w mechanizmy transkrypcyjne regulujące nabywanie fenotypu sekrecyjnego neuroendokrynny.Obrazy
[przypisy: krążek międzykręgowy, kora debu, mcz lubin ]